數(shù)字PCR被稱為“第三代PCR技術(shù)”，其最大的特色是將單個核酸分子分配到獨(dú)立的反應(yīng)室，經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熒光信號檢測，實(shí)現(xiàn)單分子定量。數(shù)字PCR技術(shù)不依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時具有極高的靈敏度、準(zhǔn)確度和極佳的重復(fù)性，是超越實(shí)時熒光PCR的一種絕對定量分析技術(shù)。

數(shù)字PCR技術(shù)與生俱來的優(yōu)勢：1）能夠檢測稀少的珍貴樣本；2）能夠檢測成分復(fù)雜的樣本；3）能夠減少PCR抑制劑的影響。這些優(yōu)勢拓寬了數(shù)字PCR在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。

1. SNV檢測
單核苷酸位點(diǎn)變異（SNV），包括常見的點(diǎn)替換、插入或缺失。腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷中，常?？梢詸z測到腫瘤驅(qū)動基因的點(diǎn)變異，如TP53 R175H，EGFR L858R，KRAS G12V，NRAS Q61R，BRAF V600E等。二代測序技術(shù)的靈敏度可達(dá)到1%，在檢測的數(shù)據(jù)量上優(yōu)勢很大，但在檢測一些背景信號很高或變異頻率很低的樣本時比較乏力。數(shù)字PCR的靈敏度為0.01%，甚至0.001%，對于千分之幾級別的低頻突變不僅可以檢測到，而且能夠精確定量。

在“精準(zhǔn)醫(yī)療”風(fēng)行的今天，微創(chuàng)或無創(chuàng)的“液態(tài)活檢”也漸漸替代了“組織活檢”，占了上風(fēng)。實(shí)際上，常用的體液樣本（如血液、胸腹水、尿液等）中游離DNA（cfDNA）很少，而ctDNA更少，只占約1%。如此微量的核酸，NGS靈敏度不足以精確檢測，而數(shù)字PCR卻可以通過微液滴處理，在每個微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，檢測到痕量ctDNA。

2. CNV檢測
除了SNV之外，異常的拷貝數(shù)變異（CNV）也是許多人類疾?。ㄈ绨┌Y、遺傳病、心血管疾?。┌l(fā)生的重要分子機(jī)制。數(shù)字PCR的“微分”技術(shù)，擺脫對Ct值的依賴，直接獲取靶基因的絕對拷貝數(shù)，其檢測精度遠(yuǎn)超二代測序、芯片雜交等技術(shù)平臺。因此，數(shù)字PCR技術(shù)可以對NGS、aCGH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有效驗(yàn)證，作為其真實(shí)性的二次確認(rèn)。同時，CN評估的主要技術(shù)瓶頸是如何在統(tǒng)計置信度下有效區(qū)分連續(xù)的CN。隨著CV增加，目標(biāo)遺傳物質(zhì)之間的差異百分比下降，使得CNV的檢測更加困難。數(shù)字PCR系統(tǒng)通過在上萬個微液滴中進(jìn)行CNV特定片段的擴(kuò)增反應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)對高連續(xù)拷貝數(shù)（例如5 vs 6, 甚至10 vs 11）的區(qū)分。

3.  基因融合檢測
非小細(xì)胞肺癌患者中，一小部分會檢測到ALK融合；不吸煙的肺腺癌患者中，ROS1融合則比較多見。臨床上檢測基因融合，一般使用免疫組化（IHC）、熒光原位雜交（FISH）和逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR的方法。IHC簡便易行，但靈敏度低，假陰性高，陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)因人而異。FISH作為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度和特異性高，但仍有較高的假陰性概率；不僅耗時長，對操作和判讀的要求也很高。RT-PCR具有快速簡單的特點(diǎn)，但因樣本降解或污染也存在一定的假陽性和假陰性。數(shù)字PCR的高靈敏度、高準(zhǔn)確度特點(diǎn)，加之對干擾的耐受力，可實(shí)現(xiàn)融合基因的精確定量。

4. CRISPR
“基因編輯”的概念隨著CRISPR-Cas9技術(shù)受熱捧而被大眾熟知，最近更是因?yàn)椤笆桌庖甙滩〉幕蚓庉媼雰骸倍兊脽胧挚蔁?。但CRISPR-Cas9技術(shù)尚未達(dá)到百分百的成功率，基因編輯常常存在不可預(yù)期的“脫靶”效應(yīng)。如何驗(yàn)證基因編輯的成功性，NGS在靈敏度上力有未逮，而數(shù)字PCR技術(shù)則可以大顯身手。據(jù)悉，Broad研究所張鋒團(tuán)隊發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)，能夠?qū)怂徇M(jìn)行高靈敏度的定性檢測，但對基因編輯效率精確定量評估時仍采用了數(shù)字PCR技術(shù)。

5. NGS驗(yàn)證和文庫定量
NGS測序公司通常使用Qubit或熒光qPCR對NGS文庫進(jìn)行定量。Qubit對異源雙鏈DNA不具有辨別力，熒光qPCR受染料的影響比較大，定量依賴擴(kuò)增的效率，兩者精度都不及ddPCR。除此之外，ddPCR還能獲取樣本的定性信息，提高NGS的成功率，并對NGS的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

6. 病毒載量絕對定量
病毒載量是指單位血漿中含有的游離病毒RNA拷貝數(shù)，該指標(biāo)可以提示病毒感染者所處的時期、判定疾病的進(jìn)展、監(jiān)測抗病毒藥物的療效，還可觀察耐藥性問題。普通的檢測手段如逆轉(zhuǎn)錄PCR，不能對其精確定量，或可引起對患者狀況的誤判。而利用數(shù)字PCR則可以對病毒載量進(jìn)行絕對定量，避免后續(xù)的問題。

7. 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷
產(chǎn)前診斷從侵入性的羊膜穿刺術(shù)、絨毛取材術(shù)到無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（NIPT），技術(shù)的發(fā)展帶來了便利，減輕了孕婦的痛苦也避免了流產(chǎn)的發(fā)生。目前基于NGS平臺的NIPT所能檢測到的項(xiàng)目（13、18、21三體綜合征等），受限于平臺的低精確度。數(shù)字PCR的高靈敏度和精準(zhǔn)度是未來應(yīng)用于NIPT的良好基石。據(jù)報道，數(shù)字PCR已在脊髓性肌萎縮、血友病、鐮刀型貧血等遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中顯示出了卓越的性能。

8. miRNA精確定量
miRNA是一類長約22nt的非編碼RNA，能夠調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，并且受到外泌體的保護(hù)而穩(wěn)定地存在于外周循環(huán)中，有望成為癌癥早期檢測的生物標(biāo)志物。目前血液樣品miRNA的分析測試主要依賴qPCR，但研究發(fā)現(xiàn)，血清或血漿中的miRNA qPCR測量結(jié)果出現(xiàn)了極高的差異性，因此，qPCR的方法不能作為血液miRNA的穩(wěn)定檢測標(biāo)準(zhǔn)。qPCR與數(shù)字PCR的比較實(shí)驗(yàn)表明，數(shù)字PCR技術(shù)不僅重復(fù)性好，準(zhǔn)確性和可信度也更高。

9. 多重PCR
在同時檢測多種病原微生物或進(jìn)行基因分型時，通常需要設(shè)計多重PCR。目前市面上的雙色熒光數(shù)字PCR采取的策略是，通過調(diào)整熒光素濃度和兩種熒光素的配比，來進(jìn)行多達(dá)10重的PCR實(shí)驗(yàn)。對于新出現(xiàn)的四色熒光數(shù)字PCR而言，客戶的PCR設(shè)計空間更大，結(jié)果的區(qū)分度也更佳。

總體而言，數(shù)字PCR技術(shù)放寬了對檢測樣本的要求，但并不意味著降低了對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的要求。恰恰相反，數(shù)字PCR一定要使用專業(yè)設(shè)計的探針引物和專業(yè)配制的試劑體系，才能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的定量分析表現(xiàn)。

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