自新型冠狀病毒爆發(fā)以來，如何有效檢出感染人群、提高低病毒攜帶者和無癥狀攜帶者的檢出率，一直是各大醫(yī)院、疾控、檢疫中心關(guān)心和進(jìn)步的方向。根據(jù)世衛(wèi)組織（WHO）和中國疾病預(yù)防控制中心（CDC）研究結(jié)果，實時熒光定量PCR（RT-PCR）被定為目前診斷SARS-CoV-2感染的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，在現(xiàn)實情況中，基于RT-PCR的相對定量的檢測方法，往往出現(xiàn)“遲檢”、“漏檢”的現(xiàn)象。

比如，臨床已發(fā)現(xiàn)有過發(fā)熱癥狀的患者，胸部CT顯示肺部下葉病變等疑似病毒性肺炎癥狀，但咽拭子核酸檢測最初期無法檢出，直到病毒性肺炎發(fā)病5-6天后才顯示陽性結(jié)果。“遲檢”、“漏檢”的現(xiàn)象，可能是由于患者咽喉部病毒載量相對較低，并受限于RT-PCR技術(shù)的敏感性所致。如果在臨床檢測中無法鑒別這些假陰性，將導(dǎo)致病毒潛在傳染的風(fēng)險，留下危害社會公共安全的隱患。鑒于此，找到一種更加靈敏、準(zhǔn)確的核酸檢測方法迫在眉睫。

數(shù)字PCR是核酸檢測技術(shù)的“新寵”，自誕生以來就被寄予厚望。它利用獨特的“微分”技術(shù)，將復(fù)雜的反應(yīng)體系平均劃分為數(shù)百至數(shù)萬個微小的反應(yīng)單元，每個單元或不包含靶標(biāo)分子，或含有1至多個靶標(biāo)分子——這一隨機分配的過程符合泊松分布。在PCR實驗過程中，每個反應(yīng)單元進(jìn)行獨立的擴增。

最終，不包含靶標(biāo)分子的單元未發(fā)生明顯擴增，熒光信號低于閾值，記為“0”；包含靶標(biāo)分子的單元發(fā)生明顯擴增，熒光信號高于閾值，記為“1”。統(tǒng)計所有反應(yīng)單元，結(jié)合泊松分布公式，根據(jù)“1”的占比計算每個單元中包含的靶標(biāo)分子數(shù)目（均值），得到拷貝數(shù)的絕對數(shù)值。

數(shù)字PCR技術(shù)減少了模板之間的反應(yīng)競爭，降低了PCR抑制因子的影響，能夠檢測低至1拷貝的目標(biāo)分子，在低載量病毒檢測中如同“火眼金睛”，去偽存真。該團(tuán)隊采用了銳訊生物的SARS-CoV-2 ORF 1ab和N基因的引物、探針，同時在熒光定量PCR和優(yōu)化好的微滴式數(shù)字PCR上進(jìn)行測試比較，發(fā)現(xiàn)ddPCR的檢測限明顯低于RT-PCR。

在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊利用ddPCR技術(shù)對臨床上采集到的77例咽喉拭子樣本進(jìn)行復(fù)檢，并與RT-PCR進(jìn)行多方面對比。其中，26例RT-PCR判定為陰性的樣本在ddPCR上復(fù)檢為陽性，而這些樣本均來自COVID-19患者。綜合對比的結(jié)果顯示，數(shù)字PCR方法比RT-PCR具有更高的檢測靈敏度（94% vs 40%），降低了負(fù)似然比（0.06 vs 0.6），提升了整體檢測準(zhǔn)確性（95% vs 47%）。該研究初步揭示了數(shù)字PCR技術(shù)檢測低拷貝病毒的能力，可以鑒別更多的“假陰性”，提高檢測精準(zhǔn)性。

關(guān)于銳訊生物