近日，南通市第三人民醫(yī)院與蘇州銳訊生物科技有限公司運(yùn)用銳訊DropX數(shù)字PCR平臺(tái)及試劑盒在大量樣本中開展了新冠肺炎檢測，數(shù)字PCR相較于熒光定量PCR體現(xiàn)出了顯而易見的高靈敏度，有效避免了痕量病毒攜帶病例出院風(fēng)險(xiǎn)，并有望為無癥狀感染檢測提供新方法。相關(guān)數(shù)據(jù)已發(fā)表在medRxiv。
隨著國內(nèi)疫情防控進(jìn)入“下半場”，無癥狀感染者已引起中央高度重視。國家衛(wèi)健委宣布從4月1日起在每日疫情通報(bào)中公布無癥狀感染者情況。這對新冠病毒核酸檢測提出了更高要求。在南通市第三人民醫(yī)院的研究中，研究人員采用銳訊自主設(shè)計(jì)的4色數(shù)字PCR與檢測試劑盒，該試劑盒采用檢測病毒特有基因orf1AB（FAM熒光）和N基因（HEX熒光）以及一個(gè)人類基因（Cy5熒光）的手段，有效檢測病毒含量和樣本質(zhì)量，并能在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行三個(gè)靶基因的絕對定量檢測，最大程度地滿足高靈敏度COVID-19核酸檢測的需求，同時(shí)給出樣本質(zhì)量的相關(guān)數(shù)據(jù)。在此項(xiàng)研究中，采用數(shù)字PCR法檢測了109例來自于病人咽拭子，肛拭子和血漿樣本中新冠病毒的RNA載量。結(jié)果顯示數(shù)字PCR靈敏度和精度比熒光定量PCR至少高一個(gè)數(shù)量級，使COVID-19檢測具有更少的假陰性和假陽性結(jié)果，尤其是對于低病毒載量樣本（往往來自于無癥狀感染者，疑似病人和經(jīng)過治療接近治愈的病人）時(shí)展示了顯著的優(yōu)勢。文章展示了數(shù)字PCR在檢測無癥狀患者和疑似患者方面的強(qiáng)大功能的證據(jù)。
數(shù)字PCR能夠通過在PCR反應(yīng)中直接定量人類RNA的內(nèi)參基因的含量來檢測核酸反應(yīng)，可以排除那些因?yàn)闃颖旧蠘恿坎蛔阍斐傻募訇幮越Y(jié)果。同時(shí)文章將治療過程中的病人新冠病毒載量的變化用數(shù)字PCR和熒光定量PCR進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR能更穩(wěn)定和更準(zhǔn)確地給出治療過程中病毒載量降低的變化趨勢。另外，文章中也對治療后兩次熒光定量PCR核酸陰性的病人樣本進(jìn)項(xiàng)了復(fù)查，發(fā)現(xiàn)少數(shù)病例仍然帶有痕量的病毒，這可能也是某些出院病人核酸復(fù)陽的原因。銳訊四熒光數(shù)字PCR系統(tǒng) （FAM/HEX/CY5/ROX） 能夠在單個(gè)多路檢測中檢測更多目標(biāo)基因，提供樣本中病毒載量的定量計(jì)數(shù)，為新冠病毒的檢測提供了更精準(zhǔn)，更靈敏的強(qiáng)大檢測手段?；?yàn)榻鉀Q熒光定量漏檢問題提供更好方案。前銳訊生物也是國內(nèi)唯一推出4色數(shù)字PCR檢測設(shè)備和新冠COVID-19核酸數(shù)字PCR檢測試劑盒產(chǎn)品的商業(yè)公司，產(chǎn)品已經(jīng)在武漢火神山醫(yī)院、中國疾控、病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及多家定點(diǎn)醫(yī)院投入使用。
以下是此項(xiàng)研究中的部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：在檢測靈敏度的實(shí)驗(yàn)中，對臨床樣本進(jìn)行梯度稀釋并檢測（S1為原始濃度樣本，S2-S8為梯度稀釋樣本），并同時(shí)采用數(shù)字PCR和熒光定量PCR檢測，可以看到當(dāng)樣本濃度逐漸降低的過程中，數(shù)字PCR可以檢測到2-3個(gè)拷貝的病毒核酸，且整體檢測線性關(guān)系更好。而熒光定量PCR在病毒核酸約為20-30左右時(shí)ct值為38.5，達(dá)到檢測限附近，且擴(kuò)增的線性關(guān)系已經(jīng)發(fā)生較大偏離（上一個(gè)5倍的稀釋梯度的ct為35，如果使用ct差異來計(jì)算，應(yīng)為10倍差異）。
圖注：橘紅色為內(nèi)參基因，綠色為N基因，藍(lán)色為COVID-19 ORF1ab 基因。
S1樣本：熒光定量法 Ct=35 數(shù)字PCR法檢出
S2樣本：熒光定量法 Ct=38.5 數(shù)字PCR法檢出 
S3樣本：熒光定量法 未檢出 數(shù)字PCR法檢出
S4樣本：熒光定量法 未檢出 數(shù)字PCR法檢出
S5-8樣本：數(shù)字PCR與熒光定量均未檢出
同時(shí)，為了提升對待檢測樣本的質(zhì)量評估能力，銳訊試劑盒同步引入的Cy5通道作為內(nèi)參基因使用，在實(shí)際臨床樣本S13 樣本為一個(gè)新冠確診患者，已經(jīng)入院接受治療一段時(shí)間，接近治愈階段，醫(yī)院用qPCR和數(shù)字PCR對此例樣本進(jìn)行檢測，來判斷核酸檢測是否為陰性，病人是否符合出院標(biāo)準(zhǔn)，qPCR 測出了N 和E基因陽性，ORF1ab 基因未檢出。ddPCR ORF1ab和N基因均陽性檢出，同時(shí)內(nèi)參基因濃度很高，證明這個(gè)樣本呈弱陽性，病毒載量很低。數(shù)字PCR結(jié)果顯示病人尚未符合出院標(biāo)準(zhǔn)，體內(nèi)仍殘留痕量病毒。出院可能會(huì)造成復(fù)發(fā)，感染其他健康人群的風(fēng)險(xiǎn)。如果采用qPCR檢測結(jié)果，病人可能會(huì)被判為陰性而出院。
S13樣本：
左圖為orf1AB（FAM熒光）和N基因（HEX熒光）
右圖為orf1AB（FAM熒光）和人內(nèi)參基因（Cy5熒光）
S13樣本：熒光定量結(jié)果
根據(jù)上述對比數(shù)據(jù)，同樣的試劑盒在銳訊數(shù)字PCR平臺(tái)上比qPCR平臺(tái)靈敏度高至少一個(gè)數(shù)量級，非常適合CDC或臨檢中心對新型冠狀病毒進(jìn)行定量檢測；對有接觸史或高危地區(qū)無癥狀的“隱形病人”進(jìn)行排查；對患者治療過程中的病毒載量變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測；對治愈病人進(jìn)行核酸陰性確認(rèn)，避免因?yàn)闄z測靈敏度的問題漏檢某些仍然可能攜帶殘留病毒的病人。
研究中同時(shí)表明，某患者于2020年2月4日首次出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽和肌肉疼痛癥狀，然后于2020年2月13日住院。然而，在2月14日至2月25日所有6次RT-PCR測試中，RT-PCR的咽拭子呈陰性。CT結(jié)果顯示雙肺部都有感染。然而，由于陰性RT-PCR結(jié)果，患者被歸類為疑似病例。雖然數(shù)字PCR在2月14日，即患者攝入后的第二天出現(xiàn)陰性結(jié)果，但從2月18日起，樣本中報(bào)告SARS-CoV-2病毒載量低（ORF1ab基因濃度為0.34份/μl，N基因?yàn)?.43份/μl）。2月14日的陰性結(jié)果很可能是由于樣品加載不足。內(nèi)部參考基因的濃度僅為1.892拷貝/μl，表明測試中RNA負(fù)荷較低。2月18日，數(shù)字PCR檢測結(jié)果為陽性，內(nèi)部參考基因濃度為20.8拷貝/μl。研究還表明，2月14日dPCR結(jié)果為陰性，原因是RNA負(fù)荷不足，可能與樣品核酸萃取過程中樣品采集不當(dāng)或RNA損失有關(guān)。CT掃描結(jié)果支持了數(shù)字PCR的結(jié)論，即該患者感染了新冠病毒，數(shù)字PCR核酸檢測為陽性。這名患者接受了莫西氟沙金、阿爾比多爾和普迪蘭的治療。
關(guān)于銳訊生物
銳訊生物（RainSure Scientific）成立于2017。創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)成員為來自美國常春藤盟校和頂尖大學(xué)的博士，擁有扎實(shí)的學(xué)術(shù)背景和豐富的工業(yè)界經(jīng)驗(yàn)。核心團(tuán)隊(duì)曾供職于業(yè)內(nèi)享有盛譽(yù)的老牌生物科技公司，多次參與和主導(dǎo)多款業(yè)內(nèi)知名產(chǎn)品的開發(fā)。自成立以來，銳訊生物秉承全球研發(fā)中國智造的理念，以創(chuàng)新、智造、助力健康為己任，專注于大健康領(lǐng)域的前沿技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)品開發(fā)。
目前，銳訊生物產(chǎn)品涵蓋數(shù)字PCR系統(tǒng)、微流控解決方案兩大板塊。并在蘇州（蘇州銳訊生物科技有限公司）與美國分別建立了生產(chǎn)基地。銳訊生物在國際上屢獲佳評，曾獲中國科協(xié)首屆海外創(chuàng)業(yè)大賽美西組冠軍、2018年蘇州工業(yè)園區(qū)創(chuàng)業(yè)型領(lǐng)軍企業(yè)、2018年姑蘇創(chuàng)業(yè)天使企業(yè)、2018年江蘇省留學(xué)回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目立項(xiàng)單位、2019年江蘇省高新技術(shù)企業(yè)培育庫等多項(xiàng)榮譽(yù)，并先后獲得真格基金、火山石資本、明勢資本、元生創(chuàng)投等國內(nèi)外知名機(jī)構(gòu)投資。
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