近日在British Journal of Heamatology (影響印章6.5) 的期刊上有一篇由上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液和腫瘤科發(fā)表的名為“Droplet digital PCR: An effective method for monitoring and prognostic evaluation of minimal residual disease in JMML”文章，該文章是關(guān)于使用液滴數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）技術(shù)監(jiān)測和評估幼年骨髓單核細胞白血?。?/span>Juvenile Myelomonocytic Leukemia, JMML）微小殘留?。?/span>Minimal Residual Disease, MRD）的回顧性研究。
JMML是一種罕見的骨髓增生性腫瘤，主要發(fā)生在兒童群體中。90%以上的JMML病例攜帶RAS通路基因突變，其中以PTPN11基因突變最為常見。JMML需要進行造血干細胞移植（HSCT）才能治愈。而大部分患者在造血干細胞移植后一年內(nèi)復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時間為 2-4 個月。因此，動態(tài)監(jiān)測最MRD水平并及時干預(yù)可改善預(yù)后。由于 RAS 通路突變是 JMML 病例的發(fā)病機制、基于病理基因的分子 MRD 監(jiān)測可加強疾病復(fù)發(fā)的早期檢測，從而為早期干預(yù)提供機會，防止復(fù)發(fā)。
ddPCR是核酸定量技術(shù)中的佼佼者，其檢測限為 0.001%。除致病性體細胞 RAS 突變外，在以往的 JMML 研究中，它在檢測 SETBP1 和 JAK3 等罕見亞克隆突變方面已被證明優(yōu)于其他基因組學(xué)方法。此外，它的快速性和成本效益也使其成為常規(guī)臨床評估 JMML 疾病負擔(dān)的理想候選方法。在本研究中，作者利用 ddPCR 對一組接受 HSCT 后的 JMML 患者進行了回顧性動態(tài)監(jiān)測。ddPCR 不僅能有效檢測疾病復(fù)發(fā)，還有助于揭示 JMML 病程中的分子事件。
在這篇文章中，作者使用了銳訊生產(chǎn)的液滴數(shù)字 PCR 系統(tǒng)（RainSure Scientific 公司，中國蘇州）進行數(shù)字PCR檢測。啟動程序包括在 96°C 下保持 10 分鐘，然后在 96°C 下變性 2 分鐘，在 56°C 下退火/延伸 30 秒，循環(huán) 40 次?；蛴嫈?shù)分析系統(tǒng)（GeneCount Analysis System，RainSure Scientific，中國蘇州）建立了用于區(qū)分陰性和陽性區(qū)域的檢測參數(shù)，可對突變比率進行量化。
這是第一份使用 ddPCR 對造血干細胞移植后 JMML MRD 進行精確監(jiān)測的報告，為了解殘留白血病的動態(tài)變化提供了寶貴的信息。通過對 32 例造血干細胞移植后 JMML 患者的回顧性分析，ddPCR 能準確識別臨床復(fù)發(fā)，并比傳統(tǒng)方法更靈敏地檢測到白血病狀態(tài)的波動。以前的干預(yù)策略，如減少免疫抑制療法（IST）或供體淋巴細胞輸注（DLI），效果有限，這可能是由于嵌合體分析識別復(fù)發(fā)階段的時間較晚。
使用 ddPCR 進行監(jiān)測有助于檢測早期分子復(fù)發(fā)，從而在檢測到早期分子波動時及時實施干預(yù)措施并使用去甲基化藥物進行維持治療，這可能有助于預(yù)防未來的 JMML 復(fù)發(fā)。此外，ddPCR 還能在單次反應(yīng)中同時精確檢測供體 DNA 以進行嵌合體分析。ddPCR 的多方面監(jiān)測能力有助于更準確地顯示疾病狀態(tài)。
圖1. 監(jiān)測 JMML 患者 HSCT 后的疾病狀態(tài)。(A、B）散點圖說明了在不同隨訪時間點，通過 ddPCR 在 JMML 患者骨髓樣本中檢測到的典型 RAS 突變。圖中顯示了帶有標準偏差線的平均值。(C) 與傳統(tǒng)技術(shù)（STR-PCR、MFC 和血液形態(tài)學(xué)）相比，通過 ddPCR 評估復(fù)發(fā)動態(tài)。垂直虛線代表復(fù)發(fā)的臨床診斷，關(guān)鍵事件（DLI、IST、二次造血干細胞移植和死亡）沿水平時間軸標出。(D) 在六名非復(fù)發(fā)患者中觀察到的 ddPCR-MRD 水平波動，并與 STR-PCR 檢測結(jié)果進行比較與 STR-PCR 檢測結(jié)果的比較。BM，骨髓； DLI，供體淋巴細胞輸注； IST，免疫抑制療法；STR-PCR，短串聯(lián)重復(fù)聚合酶鏈反應(yīng)。
ddPCR 可以靈敏地檢測早期分子失效，這對預(yù)防 JMML 疾病進展至關(guān)重要。它使我們能夠首先在分子水平上理解 JMML 白血病負荷的動態(tài)變化，為了解疾病的本質(zhì)提供有價值的信息。它在 JMML 造血干細胞移植后的常規(guī)監(jiān)測和預(yù)后評估中起著至關(guān)重要的作用。作者建議至少在造血干細胞移植后的前 3 個月每月進行一次 BM MRD 評估。此外，根據(jù)造血干細胞移植后 1 個月的 ddPCR-MRD 水平確定高?；颊?，可以優(yōu)化 JMML 的管理。